技术文章您的位置:网站首页 >技术文章 > 细胞冻存和细胞复苏对人ELISA试剂盒实验的影响
细胞冻存和细胞复苏对人ELISA试剂盒实验的影响
发布时间:2021-01-21   点击次数:140次
  细胞冻存和细胞复苏对人ELISA试剂盒实验的影响
  1. 液氮法
  目前,细胞冻存常用的技术是液氮冷冻保存法,主要采用加适量保护剂的缓慢冷冻法冻存细胞。细胞冷冻技术的关键是尽可能地减少细胞内水分,减少细胞内冰晶的形成。人elisa试剂盒采用或二甲基亚砜作保护剂,这两种物质分子量小,溶解度大,易穿透细胞,可以使冰点下降,提高细胞膜对水的通透性,且对细胞无明显毒性。慢速冷冻方法又可使细胞内的水分渗出细胞外,人ELISA试剂盒减少胞内形成冰结晶的机会,从而减少冰晶对细胞的损伤。常用的细胞冷冻贮存器为液氮贮存器,规格有35L3和50L3两种。
  细胞冻存时常备的材料有:0.25%胰蛋白酶,含10%~20%的血清培养液,DMSO(分析纯)或无色新鲜(121°C蒸气高压消毒),2mL安瓿(或细胞冻存管)、吸管、离心管、喷灯、纱布袋(或冻存管架)等。
  主要操作步骤为:
  (1)选择处于对数生长期的细胞,在冻存前一天换液。将多个培养瓶中的细胞培养液去掉,用0.25% 胰蛋白酶消化。适时去掉胰蛋白酶,加入少量新培养液。用吸管吸取培养液反复吹打瓶壁上的细胞,使其成为均匀分散的细胞悬液。悬浮生产细胞则不要消化处理。然后将细胞收集于离心管中离心(1000r/min,10分钟)。
  (2)去上清液,加入含20%小牛血清的完全培养基,于4℃预冷15分钟后,逐滴加入已无菌的DMSO或,用吸管轻轻吹打使细胞均匀,细胞浓度为3×106~1×107/mL之间。
  (3)将上述细胞分装于安瓿或冷冻塑料管中,安瓿装1~1.5mL在火焰喷灯上封口,封口处要完全封闭,圆滑无勾。冷冻管要将盖子盖紧,并标记好细胞名称和冻存日期,同时作好登记(日期、细胞种类及代次、冻存支数)。
  (4)将装好细胞的安瓿或冻存管装入沙布袋内;置于液氮容器颈口处存放过夜,次日转入液氮中。采用控制降温速度的方法也可采用下列步骤:先将安瓿置入4℃冰箱中2~3小时,再移至冰箱冷冻室内3~4小时(此步可省略),再吊入液氮容器颈气态部分存放2小时,zui后沉入液氮中。
  2. 分布降温法
  细胞系冻存程序:
  (1)单层细胞的消化。将经24~48小时培养已长成单层的传代细胞培养物弃去生长液,加适量ATV,1~2分钟后倒弃ATV,再加入少量ATV液,经0.5~1分钟倒去ATV,室温或37oC温箱作用2~3分钟,视细胞解离情况,拍打细胞培养瓶。使单层细胞完全解离。SP2/0瘤细胞,待生长好后用吸管吹打,再经1 000转/ 分离心lO分钟。
  (2)离心洗涤:向培养瓶内加5~1 0m1预冷的MEM使细胞悬浮,人ELISA试剂盒再将其吸出置灭菌离心管中,以1 000rpm 离心8~10分钟后弃去上清液。
  (3)细胞悬液的制备:向离心管内逐滴缓慢加入预冷的冻存保护液,使细胞浓度为150~400万/ml,然后迅速分装于安瓿瓶中,每瓶加量为lml。
  (4)致冷冻结:将安瓿瓶放入带有棉垫的纸盒或塑料盒内,直立置不同条件下致冷冻结果保存:
  a、4oC两小时后移至一2OoC作用2小时,再移入一4OoC4小时后在一7OoC下24小时投入液氮。
  b、一20oC4小时后移致一4OoC。C经4小时移人一7OoC冰箱24小时,投入液氮。
  c、一4OoC4小时后移入一70oC24小时后投入液氮。
  d、一20oC4小时后移入一70oC经24小时后投入液氮中。
  e、一70oC24小时后投入液氮中。
  (5)液氮中保存:将冻结后的安瓿装入预冷的小布袋中,投入液氮。为防止安瓿漂浮,可预先在小布袋中加入几块小卵石。
  3.玻璃化法
  玻璃化保存(Vitrification)是一种超速冷冻方法。它是以极快的速度冷冻细胞,使细胞内外的游离水迅速形成玻璃样物质,而不形成冰晶。人ELISA试剂盒这种保存方法既避免了由于慢速降温时导致的盐浓度升高,又防止了由于冰晶形成造成的物理损伤,可获得较高存活率。玻璃化首先由Luyet在1937年提出,他认为生命是生物活体系统的原子或其他结构元的一种特殊排列.并且轻微的排列位置扰动就会破坏平衡从而导致死亡,而结冰时的驱动力会破坏这种特殊的排列,这就是冰冻死亡的原因。玻璃化比冻结固化方法引起的结构变化要小,因而是一种较理想的低温保存途径。1981年,Fahy首先明确提出,用高浓度的低温保护剂溶液,可在较慢地冷却速率以及高压条件下实现完全的玻璃化,以后又发展了一些所谓“玻璃化溶液”,使细胞、组织乃至器官等范围广泛的生物系统玻璃化低温保存成为可能。1985年,Rail和Fahy[ 目用这种玻璃化溶液使鼠胚胎玻璃化保存获得成功,是这种技术走向实用化的突破。
  1.细胞复苏的原则
  在实际操作中,冻存细胞要进行复苏,再培养传代。复苏细胞一般采用快速融化法。以保证细胞外结晶快速融化,以避免慢速融化水分渗入细胞内,再次形成胞内结晶损伤细胞。
  2.细胞复苏的主要操作步骤
  (1)佩戴眼镜和手套,从液氮罐中取出安瓿或冷冻管。
  (2)迅速放入38℃水浴中,并不时摇动,在1分钟内使其完全融化,然后在无菌下取出细胞。
  (3)在1000r/min速度下离心5~10分钟,弃去上层液,加入适量培养液后接种于培养瓶中,接种浓度1×109/L,置37℃温箱静置培养,次日更换一次培养液,继续培养,观察生长情况。若细胞密度较高,及时传代。或无需离心直接将细胞加入瓶中,并加入培养基贴壁培养12~24小时后,充去上清,换入新鲜培养基继续培养。
  3.注意事项
  在细胞复苏操作时,应注意融化冻存细胞速度要快,人ELISA试剂盒可不时摇动安瓿或冷冻管,使之尽快通过zui易受损的温度段(-5~0℃)。这样复苏的冻存细胞存活率高,生长及形态良好。然而,由于冻存的细胞还受其他因素的影响,有时也会有部分细胞死亡。人ELISA试剂盒此时,可将不贴壁、飘浮在培养液上(已死亡)的细胞轻轻倒掉,再补以适量的新培养液,也会获得较为满意的结果。
Copyright © 2019 上海瑞番生物科技有限公司 All Rights Reserved.  网站地图  沪ICP备19024474号-5  管理登陆  技术支持:化工仪器网
上海瑞番生物科技有限公司(www.shruifansw.com)主营:ELISA试剂盒,试剂,耗材等产品
在线客服 二维码

扫一扫,关注我们